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合作文章│Science Advances: 巨噬细胞中的Gasdermin
合作文章 2020-07-10 16:58
合作文章│Science Advances: 巨噬细胞中的Gasdermin D通过控制cGAS介导的炎症来抑制结肠炎
英文标题:Gasdermin D in macrophages restrains colitisby controlling cGAS-mediated inflammation
中文标题:巨噬细胞中的Gasdermin D通过控制cGAS介导的炎症来抑制结肠炎
发表期刊:Science子刊Science Advances
影响因子:12.804
技术手段:小鼠结肠组织LC-MS/MS cGAMP靶标定量
敏心生物协助南京医科大学发表文章于Science子刊Science Advances
 
 
研究背景
       炎症性肠病(IBDs)是一种慢性的、复杂的疾病,其特征是肠道致病性炎症失控和肠组织损伤。炎症小体在黏膜免疫和结肠炎中的作用的潜在机制尚不清楚。一般认为炎症相关蛋白以微生物群依赖的方式在实验性结肠炎中发挥保护作用,但也有研究表明,有的炎症小体在基线结肠内粘液层中可能不需要形成或具备功能。最近发现Gasdermin D(GSDMD)能够在炎症激活下游中发挥作用,造成细胞凋亡。GSDMD与感染性休克和实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)等疾病的潜在发病机制有关,但是GSDMD对结肠炎的作用的功能相关性和机制基础尚不清楚。
 

研究方法
1、对小鼠进行急性实验性结肠炎诱导。收集结肠进行免疫细胞和组织学等分析。
2、用ELISA法测定促炎细胞因子的产生,然后用RT-PCR进行扩增。
3、用ELISA试剂盒采集结肠匀浆上清液,测定cGAMP含量。
4、UPLC/MS分析:采用甲醇法提取样品,然后进行LC/MS分析。色谱柱为ACQUITY UPLC BEH Ami(100×2.1 m m,1.7μm)。
5、对结肠组织切片进行组织学分析和免疫荧光染色分析,以及对结肠上皮细胞和免疫细胞进行分离及FACS分析与分选。
6、将纯化的巨噬细胞采用ELISA检测细胞因子的产生,用RT-qPCR检测细胞因子基因的表达。
7、进行16SrRNA基因测序RNA序列分析。
 
 
研究结果
       GSDMD蛋白在小鼠的各种组织中高表达,特别是在肠系膜淋巴结(MLN)和肠道中(图1A)。免疫荧光分析显示GSDMD广泛分布于LP-Cx3cr1+髓样细胞和上皮E-cadherin+细胞(图1B)。免疫印迹分析显示结肠炎小鼠结肠中GSDMD和caspase-11的表达和裂解显著增加(图1C)。由结肠炎诱导的髓系细胞GSDMD活化主要表现为30kda的裂解片段,而p30和p47片段是IECs的主要裂解带(图1D)。这些结果表明GSDMD介导的细胞凋亡在结肠炎模型中的作用。 


                                                                                                                                   
                                                                                                                                                ( 图1)
(A)免疫印迹法分析GSDMD-/-和野生型(WT)小鼠心脏、肝脏、肾脏、肺、mLNs、脾脏、小肠(SI)、结肠、皮质、中脑和小脑中GSDMD的表达;
(B)免疫荧光标记野生型小鼠结肠切片中GSDMD(红色)、4′、6-二氨基-2-苯基吲哚(蓝色)和Cx3cr1报告小鼠结肠切片中GSDMD(绿色)、Cx3cr1(红色)和DAPI(蓝色);
(C)对照组或DSS处理的WT小鼠在第9天结肠中GSDMD和caspase-11的免疫印迹分析;
(D) DSS处理的WT小鼠第9天结肠IECs和骨髓细胞中GSDMD全长和裂解的免疫印迹分析。


       GSDMD在DSS诱导的结肠炎中起保护作用,GSDMD的缺乏会加重DSS诱导的结肠炎,保护结肠巨噬细胞在结肠炎期间免于死亡。炎症小体可以通过调节AMPs的产生来改变微生物的组成,从而避免结肠炎细菌的生长,GSDMD对AMPs和粘液的产生没有影响,但对控制结肠炎症是必不可少的。骨髓细胞中的GSDMD对DSS诱导的结肠炎的保护作用至关重要,巨噬细胞中GSDMD的功能对结肠炎的表型具有负性调节作用。GSDMD缺乏增强结肠炎时结肠巨噬细胞cGAS依赖性炎症。
       采用RNA测序分析DSS诱导结肠炎的发病阶段(图2A)。KEGG分析表明,GSDMD-CD11b+F4/80+细胞上调的最主要途径之一是细胞溶质DNA感应途径,其中细胞溶质DNA被cGAS感应并触发炎症反应(图2B)。基因集富集分析(GSEA)和基因网络分析进一步强调了GSDMD在调控DNA传感途径中的关键作用(图2C和D)。与此一致,热图和RT-PCR分析显示,许多与cGAS依赖性炎症相关的基因在GSDMD-细胞中的表达显著增加(图2E和F)。然后在结肠炎期间测量了WT和GSDMD-/-结肠组织中的cGAMP浓度,并检测到GSDMD-/-结肠组织中的cGAMP水平高于WTs(图2G)。在DSS激发后,GSDMD-结肠组织中STING、TBK1和IRF3的磷酸化显著增加。

                                                                         (图2)
(A)结肠巨噬细胞分类;
(B) KEGG分析WT和GSDMD-小鼠分离的结肠巨噬细胞中最显著富集的信号通路;
(C)小鼠结肠巨噬细胞“胞浆DNA感应途径”相关基因的GSEA;
(D)小鼠结肠巨噬细胞胞浆DNA传感途径相关基因的基因网络分析;
(E)基因热图;
(F) RT-qPCR分析小鼠结肠巨噬细胞中的指示基因;
(G)WT和GSDMD小鼠结肠组织中cGAMP水平的UPLC/MS分析;
(H)免疫印迹分析



       本研究提出了一个模型,结肠巨噬细胞中的GSDMD控制cGAS介导的炎症,以应对粘膜屏障损伤后侵袭的肠道细菌或受损的肠上皮,从而防止结肠炎的发展(图3)。因此,开发专门针对GSDMD-cGAS信号的诊断和治疗策略可能有助于预防IBD。


                                                                                                                 (图3)
DSS诱导的结肠炎GSDMD功能模型。结肠巨噬细胞中的GSDMD控制cGAS介导的炎症反应,以应对粘膜屏障损伤后侵袭肠道细菌或受损肠上皮的DNA,从而防止结肠炎的发生。


总结
       在本研究中,观察到GSDMD蛋白在化学诱导结肠炎模型的肠道炎症过程中被激活。GSDMD缺乏症加重实验性结肠炎不受微生物群变化的影响,也不影响抗菌肽的产生。GSDMD缺乏巨噬细胞,但不是上皮细胞,足以驱动这个恶化的实验性结肠炎。并进一步证明了GSDMD在巨噬细胞中发挥负调控作用,控制环GMP-AMP合成酶(cGAS)依赖性炎症,从而保护结肠炎。此外,使用cGAS抑制剂可以挽救gsdmd缺陷小鼠的大肠杆菌表型。总的来说,本文首次证明了GSDMD在控制结肠炎中的作用,并详细描述了其潜在机制。